激光掃描共聚焦熒光顯微鏡是一種利用計算機、激光和圖像處理技術(shù)獲得生物樣品三維數(shù)據(jù)、目前*的分子細胞生物學(xué)的分析儀器。主要用于觀察活細胞結(jié)構(gòu)及特定分子、離子的生物學(xué)變化，定量分析，以及實時定量測定等。

 

傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡使用的是場光源，標本上每一點的圖象都會受到鄰近點的衍射光或散射光的干擾。激光共聚焦顯微鏡利用激光束經(jīng)照明針孔形成點光源對標本內(nèi)焦平面上的每一點掃描標本上的被照射點，在探測針孔處成像，由探測針孔后的光電倍增管( PM T)或冷電耦器件( cCCD)逐點或逐線接收，迅速在計算機監(jiān)視器屏幕上形成熒光圖象。照明針孔與探測針孔相對于物鏡焦平面是共軛的，焦平面上的點同時聚焦于照明針孔和發(fā)射針孔，焦平面以外的點不會在探測針孔處成像。這樣得到的共聚焦圖象是標本的光學(xué)橫斷面，克服了普通顯微鏡圖象模糊的缺點。

 

與傳統(tǒng)顯微鏡相比，激光激光激光共聚焦顯微鏡具有高分辨率，高靈敏度和高放大倍率。隨著軟件開發(fā)和應(yīng)用技術(shù)的發(fā)展，激光激光激光共聚焦顯微鏡已成為形態(tài)學(xué)，分子細胞生物學(xué)，神經(jīng)科學(xué)，藥理學(xué)和遺傳學(xué)領(lǐng)域的新一代強大的研究工具。

 

激光共聚焦顯微鏡的操作步驟：

 

1、根據(jù)熒光探針的激發(fā)和發(fā)射波長選擇合適的激光，激光功率，光譜濾光片和發(fā)射濾光片。

2、確定掃描方法：點，線，面，3D掃描。

3、確定掃描密度（分辨率）：256×256,512×512,1024×1024,2048×2048，分辨率越高，掃描速度越慢，圖像信噪比越好，但越多可能會發(fā)生光漂白。

4、選擇共焦顯微鏡物鏡的倍數(shù)和電子放大倍率：確定此條件后，確定掃描范圍，物鏡的透光率與數(shù)值孔徑（NA）的四次方成正比，并且物鏡放大倍數(shù)的平方。因此，反比例，應(yīng)盡可能選擇具有高數(shù)值孔徑的物鏡。

5、根據(jù)樣品的制備質(zhì)量，選擇合適的針孔尺寸，調(diào)節(jié)激光管電壓，光電倍增管功率，降噪等，達到最佳狀態(tài)。這些參數(shù)的選擇或設(shè)置非常緊密，應(yīng)該全面考慮。

6、確定光線切割范圍，即掃描樣品的厚度，起始位置和結(jié)束位置。

7、給出了由光切割的層數(shù)和拍攝時的累積平均次數(shù)。

8、獲取圖像并保存。